淋巴结肿大，提高诊断效率少不了它

淋巴细胞增生性疾病诊断是有难度的，常依靠形态学、免疫组织化学和细胞遗传学等常规方法，但各有局限，临床要如何提高它的诊断率呢。

作者丨曹增

审核丨医院血液科

来源丨医学界肿瘤频道

淋巴细胞增生性疾病诊断难在哪儿？

临床将淋巴细胞增生性疾病分为免疫性（或反应性）和恶性两大类，其中如急慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，在诊断上都有一定难度。

1.免疫性或反应性淋巴增生性疾病：由免疫反应所引起的淋巴系统增生性疾病，常伴淋巴细胞形态异常，多为良性。

2.淋巴系统恶性增生性疾病：病因尚未阐明，通俗的讲，是异常淋巴细胞在人体中疯长，正常造血细胞受到抑制而无法发挥其正常功能的一种状态。其中非霍奇金淋巴瘤是病理学分类最复杂、最混乱的一类疾病，而我国非霍奇金淋巴瘤占恶性淋巴瘤的89%。

刚说到，淋巴细胞增生性疾病诊断是有难度的，那么目前可用的诊断利器有哪些呢？

利器一：免疫表型分析，包括流式细胞术和免疫组化法，是诊断淋巴系统增殖性最好的辅助工具，对于淋巴瘤亚型分析起决定作用，对淋巴细胞克隆性增生也有辅助判断作用。但是，许多淋巴瘤缺乏克隆增生标志，因此依赖这些标志物的免疫表型分析法存在一定的局限性。

据报道，约有5%～10%的淋巴瘤病例在进行多种表型分析后仍难以得到最终诊断，此时则需要依赖一种分子诊断技术。

利器二：受体基因重排克隆性分析。受体基因重排这一专业性术语，许多非专业人士对此表示难以理解，今天重点带大家全面认识受体基因重排检测和其在诊疗过程中的意义。

利器二与淋巴增生疾病有何关系？

受体基因重排为淋巴细胞正常发育过程，正常状态或者发生反应性淋巴增生时，人体的每个T、B淋巴细胞均携带独特的受体基因（即多克隆性）；当发生淋巴细胞白血病或淋巴瘤时，由于肿瘤一般源于单个细胞的单克隆增生，因此克隆性增生的瘤细胞携带着相同的Ig或TCR基因（即单克隆性）。

形象地说，受体基因就像淋巴细胞的独特标记，正常个体的淋巴细胞群中，各个淋巴细胞之间互不相同（即携带不同的受体基因），采用针对重链或者轻链上相对保守区域的引物扩增超变区后就会产生序列和长度不一的片段。

当发生恶性肿瘤时，淋巴细胞群中的某个克隆在数量上就占了绝对优势，并且仍以一定的速度持续增殖，此时对其进行扩增得到的产物则是相同的片段。

为什么要做受体基因重排？

既然受体基因重排克隆性分析与淋巴增生疾病如此相关，它对临床有何帮助呢？

第一，用于诊断与鉴别诊断，特别是对形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变，部位少见或发病年龄不典型，缺乏特异性标记，深部肿块的穿刺或活检标本，基因重排检测具有重要指导意义。

第二，用来评估化疗效果，预示复发风险。患者经过充分治疗后残留的肿瘤细胞数量越少、下降越快提示化疗效果越好，如果肿瘤残留细胞在治疗或随访过程中不断上涨，则提示复发风险较大。

总之，受体基因重排克隆性检测的目的是在基因水平检测这个多样化的淋巴细胞群中是否存在“优势克隆”。基于PCR的基因重排克隆性检测技术通过放大作用将“优势克隆”可视化（用电泳、片段分析等产物检测技术），从基因分子角度为临床医生提供可靠的诊断线索。

值得注意的是，由于PCR的高度敏感性，研究者应该注意其产生假阳性的可能，需综合临床表现、免疫分型等做出最终的诊断。

受体基因重排检测如何做？

受体基因重排克隆性分析应用于淋巴细胞增生性疾病的诊断已有近30年历史，最初采用Southern印迹杂交法，但该方法对标本质量要求严格，组织用量大且操作复杂，因而临床应用受到限制。

20世纪90年代起，PCR开始被用于受体基因重排克隆性分析并逐渐取代Southern印迹杂交法。

近几年，研究者们对受体基因重排检测技术的改进主要着眼于完善引物和建立更简便、准确的产物分析方法，研究者们创建了多种PCR产物分析方法，进一步提高了基因重排检测的敏感性、特异性，同时兼顾了操作的便捷性。

现代受体基因重排检测技术包括下面五个项目：

1.温度梯度凝胶电泳（TGGE）或变性梯度凝胶电泳（DGGE）

这些方法是依据DNA分子的熔解性质不同进行分离的。在一定的温度时DNA开始解链，形成一个分叉状结构后迁移速度会大大降低。

因为分子的熔解温度依赖于分子序列，因此分子量相同但是序列不同的DNA片段可以被分离出来。如果单克隆重排基因到达一定数量时，在特定温度位置就会出现明显的条带，而正常多克隆重排基因则在凝胶上表现为一片弥散。

2.异源双链分析

对产物变性后低温快速复性1h，这一过程会导致正常多克隆重排基因解链后迅速形成各种不同的异源双链，用非变性聚丙烯凝胶电泳后，这些构象不同的异源双链则形成弥散的条带。

而对单克隆淋巴细胞增生的患者DNA而言，快速复性后仍然形成大量同源双链，因此电泳就会产生边缘清晰的条带。

异源双链分析法无需专用设备，操作过程直截了当，费用相对较低，是目前国内最常用的常规检测方法。

3.毛细管电泳和基因扫描技术：

该法分析重排基因扩增产物的原理不同于其他技术，采用荧光标记的引物进行PCR扩增，将产物变性后利用测序仪的片段长度分析功能分析单链长度。

该技术引入毛细管电泳和基因扫描技术，不仅能够精确计算出各扩增条带大小的具体数值，而且还能得到各扩增条带的清晰峰形，极大提高了准确度和灵敏度，能够在瘤细胞负荷仅为0.5%～1%时检测出单克隆重排。

目前，PCR结合毛细管电泳技术在欧美国家已经广泛应用于常规检测，并被认为是克隆性基因重排检测的“金标准”。

4.熔解曲线分析：

在PCR之前加入可与DNA双链嵌合的染料，如SybrGreenI，在荧光定量PCR仪内扩增后直接升温使产物变性，后快速降温至退火温度复性，然后缓慢线性升温并连续采集荧光信号，最后根据荧光信号对温度的一阶导数绘制熔解曲线。

该方法有望应用于疾病监测以及微小残留病的检测，它最大的优势是扩增和分析可以在一个程序内完成检测，无需转移产物，既避免了PCR产物的污染，又节省了大量劳动力，适用于大批量检测。

5.二代测序技术：

二代测序技术具备可对单个模板测序和高通量的特点，使检测背景极为复杂的受体重排基因变为可能。虽然二代测序技术的读长较短，但经过前期扩增，受体重排基因扩增产物片段几乎都在bp以内，对于读长较长的测序平台来说甚至不需要进行片段化就可直接测序。

随着二代测序技术检测速率的提高，检测成本的降低，其在受体基因重排检测方面的临床应用也将指日可待。

医院及专家简介

医院血液科创建于年，是集医疗、教学、科研、临床转化医学医院专业学科；现为国家药物临床研究基地、造血干细胞移植中心、天津医科大学博士及硕士研究生培养点，参与10余项国际、国内多中心临床研究。

血液科收治患者覆盖所有血液疾病谱，年门诊量及出入院病例数医院前列；在干细胞移植技术及血液肿瘤的研究方面处于国内领先水平，诊疗模式与国际先进水平接轨；目前以白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等血液系统恶性疾病为重点病种，建立并完善各类血液系统肿瘤的分层治疗体系，开展血液系统良恶性疾病的造血干细胞移植，同时与儿童肿瘤科合作，成功开展儿童实体瘤造血干细胞移植治疗，取得较好疗效。

张翼鷟，主任医师、教授、博士研究生导师，现任医院血液科及移植病房主任。她是中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会常委、医院血液精准诊疗专业委员会常委、中国医疗保健国际交流促进会血液学分会委员、中国医师协会多发性骨髓瘤专业委员会委员、中国抗淋巴瘤联盟委员、中国女医师协会血液专业委员会委员及青委会副主任委员、天津医师协会血液学分会副会长、天津市抗癌协会血液肿瘤专业委员会副主任委员、天津市抗癌协会老年肿瘤专业委员会主任委员。主要从事血液系统恶性肿瘤的化学治疗、靶向治疗和造血干细胞移植等综合治疗，擅长各类急慢性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征（MDS）、各类贫血、血小板减少性紫癜等疾病的诊治。

曹增，副主任技师，年毕业于南开大学，生物化学及分子生物学专业。年毕业于中国协和医科大学，分子生物学专业，获硕士学位，年7月获得副主任技师资格。年调入天津医院血液科负责实验室工作。天津抗癌协会老年肿瘤专业委员会委员，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会会员，天津抗癌协会血液肿瘤专业委员会会员。从事血液肿瘤的分子检测工作20余年，研究方向多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病的分子机制研究。目前主持省部级课题两项并已顺利结题，作为主要参加人参与多项国家自然基金。

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