病例分享5个月男婴血小板减少湿疹

作者：程学文等

医院

摘自《临床儿科杂志》年第12期

患儿，男，5个月，阵咳1周，发现血小板减少3d入院。既往史：患儿湿疹时间长，反复感染。

神志清醒，颈部皮肤可见少量红色丘疹，部分伴结痂，面部及躯干部可见少许针尖样出血点，压之不褪色；全身浅表淋巴结未触及肿大；咽部无充血，双侧呼吸对称，未闻及杂音；四肢未见异常，活动无受限。

血常规白细胞计数（WBC）：11.2×血红蛋白（Hb）：92g/L血小板计数（PLT）：42×/L血小板平均体积：6.7fl

淋巴细胞亚群CD8+及CD4+T淋巴细胞升高CD19+B淋巴细胞正常范围

免疫球蛋白IgG：13.64g/LIgA：3.25g/LIgM：0.86g/L

肝功能丙氨酸转氨酶（ALT）：U/L天冬氨酸转氨酶（AST）U/L

胸片：双肺纹理增多

骨髓细胞学：巨核细胞成熟障碍

入院后给予头孢替唑及哌拉西林钠舒巴坦钠抗感染治疗，并用丙种球蛋白和地塞米松（5mg/d）支持治疗，患儿症状未见明显好转，家长要求出院。

基因检测：

因疑似Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrichsyndrome，WAS），为进一步明确诊断，经患儿家属知情同意，对患儿及其父母的WAS基因进行检测。

抽取外周血2mL，利用提取全血基因组的试剂盒提取基因组DNA，测定其浓度。设计引物（上海生工，表1）扩增相应外显子，并对PCR产物进行Sanger测序分析。

表1WAS基因外显子扩增引物

PCR扩增反应体系为：基因组DNAng，dNTPμmol，MgCl21.5mmol，上下游引物各1μmol，TaqDNA聚合酶（TaKaRa）1U，加无菌水至终体积25μL。

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

结果显示患儿WAS基因存在c.AG突变（图1），该突变导致WAS基因编码的蛋白位氨基酸由异亮氨酸突变为颉氨酸（p.IleVal）；患儿父母均未见突变，经文献检索及数据库比对发现该位点突变未见报道。利用Polyphen2软件（得分1.00）及SIFT软件（得分0.00）预测分析，该位点为致病性突变。

图1患儿及其父母基因检测结果

不同的物种之间该位点的保守性分析发现，该位点在不同的物种间序列非常保守（图2）；推测Ile位点对于维持蛋白的正常功能具有重要的意义。

图2不同的物种之间Ile位点的保守性分析

以RCSB-PDB数据库中WAS蛋白的三维结构图（PDB数据库编号：1ej5）为模板，利用生物信息学技术把p.IleVal突变后的WAS蛋白序列三维重构，结果显示该位点突变可能影响蛋白的结构（图3）。

图3WAS蛋白部分序列的三维结构图注：A：未突变的结构图（PDB数据库编号：1ej5）；B：表示未突变的结构与p.IleVal突变的重构图（箭头所指的位置为突变位点）

Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrichsyndrome，WAS）。

WAS是一种X连锁隐性遗传病，国外流行病学显示，在新生男婴中WAS的发病率为（1~10）/000，而随着检测技术的发展，其发病率有所升高。因WAS患者的临床表现有很大的差异性，首次就诊时多被误诊为免疫性血小板减少症。依据临床表现，WAS可分为4种类型：典型的WAS综合征、X连锁血小板减少症（X-linkedthrombocytopenia，XLT），间歇性X连锁血小板减少症（intermittentX-linkedthrombocytopenia，IXLN）以及X连锁粒细胞减少症（X-linkedneutropenia，XLN）。本例患儿为典型的WAS。

年Derry等分离出WAS的致病基因，基因组全长为9kb，包含12个外显子，编码由个氨基酸组成的WAS蛋白。WAS蛋白不同功能区以及不同类型的突变可导致不同的临床表型。目前已经发现多种WAS基因突变类型，其中约有50%的突变位于EVH1区域（外显子1~4）。研究发现，发生在该区域的错义突变部分抑制WAS蛋白的功能，临床表型比较轻。典型的WAS患者突变常集中于外显子7~12，在该功能区发生移码突变或无义突变导致WASP蛋白表达缺失或者产生截短、不稳定的蛋白，该类患者多数症状严重，预后不良。

本例患儿6月龄内发病，临床表现为典型的WAS三联征。患儿WAS基因存在一错义突变C.AG(p.IleVal)，该突变位于外显子9上面，位于典型的WAS患者突变热点区域，利用生物信息学软件分析该突变可导致疾病发生，不同物种间序列保守性分析发现，该位点十分保守；结构预测分析发现该位点突变可能会影响正常的蛋白结构，进而影响蛋白功能，但对WAS蛋白功能的影响需要进一步的实验验证。

国外研究发现，大部分的WAS患者外周血IgG、IgA和IgM降低。本例患儿就属于该种情况。欧美流行病学调查显示，40%~72%的WAS患者可能会发生自身免疫性疾病，包括血管炎、自身免疫性溶血性贫血、关节炎及过敏性紫癜等；中国和日本的研究结果显示亚洲WAS患儿自身免疫性疾病的发生率低于欧美人群。

综上所述，本例典型WAS患儿中发现了新突变，C.AG(p.IleVal)突变，丰富了该基因的突变数据库。

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